Régulation de la production d'antibiotiques

Régulation de la production d'antibiotiques dithiolopyrrolones chez Saccharothrix Algeriensis NRRL B-24137, thèse, Toulouse, 2005, 283 p.

Présentation

Résumé :
Ce travail s'est donné pour objectif l'étude de l'effet de certains nutriments (acides aminés, acides organiques et acide humique) sur la production des antibiotiques dithiolopyrrolones, ainsi que l'induction de la production de nouvelles dithiolopyrrolones chez Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137 (= DSM 44581) dans un milieu semi-synthétique.
La cystine à une concentration comprise entre o et 5 mM favorise la production des dithiolopyrrolones en fournissant des précurseurs du noyau pyrrothine. Au-delà de cette concentration, la production des dithiolopyrrolones chute fortement. La présence de certains acides aminés comme L-proline, acide L-glutamique et DL-histidine et certains acides organiques comme 4-hydroxybenzoïque, benzentétracarboxylique, pantothénique et pivalique mène à une augmentation de la production des dithiolopyrrolones. En outre, les productions des dithiolopyrrolones sont fortement favorisées en présence de 0,25 g/L de l'acide humique. En revanche, la présence de certains acides aminés (cystéine, méthionine, éthionine, etc.) et acides organiques (pamoïque, benzensulfonique et syringique, etc.) a un effet inhibiteur sur la production des dithiolopyrrolones même à des concentrations peu élevées. Certains acides organiques s'incorporent directement au niveau de la chaîne latérale produisant ainsi l'antibiotique correspondant. Dans le milieu synthétique de base, Sa. algeriensis ne produit qu'un nombre limité de dithiolopyrrolones.
L'induction de nouvelles dithiolopyrrolones a été réalisée par l'addition de certains acides aminés (cysteine et cystine) et acides organiques (benzoïque, cinnamique, 4-bromobenzoïque, etc.). Dans cette étude, dix huit principales nouvelles dithiolopyrrolones ont été obtenues. Les similarités des molécules nouvellement apparues observées dans les spectres UV -visible et les fragments de masse indiquent qu'on est en présence de molécules appartenant au même groupe des dithiolopyrrolones ou des précurseurs proches des dithiolopyrrolones.
Les données ont révélés que la molécule PR 14,60 (PM =276) est une déméthyl-benzoyl-pyrrothine, une novelle molécule jamais signalée. En revanche, la nouvelle dithiolopyrrolone PR 1 6,64 est une benzoyl-pyrrothine, une molécule produite en traces dans le milieu complexe.
Des fermentations contrôlées dans des fermenteurs en batch ont été effectuées en présence de l'acide benzoïque, de l'acide tiglique, de l'acide méthacrylique et de l'acide humique (pris un à un) pour affiner les résultats obtenus en Erlenmeyers. D'après les résultats obtenus, la croissance de Sa. algeriensis dans toutes les fermentations est très rapide pendant les premières heures de culture. Les cellules de la culture témoin subissent une lyse cellulaire assez marquée alors que les cellules en présence des acides organiques se maintiennent bien. Les acides organiques en tant que source de carbone permettent la conservation de l'intégrité des cellules. Les dithiolopyrrolones ne sont produits que pendant l'idiophase.
La biosynthèse de ces antibiotiques est soumise à la régulation par les .acides organiques ajoutés. L'acide méthacrylique et l'acide tiglique, dans certaines conditions, augmentent la production de quelques dithiolopyrrolones.
En outre, une diminution de la teneur de toutes les dithiolopyrrolones est observée après les 80 h de fermentation. Ces baisses constatées des titres sont à attribuer peut être à une dégradation ou transformation des dithiolopyrrolones. Les résultats obtenus en fermenteurs ne sont pas exactement les même que ceux obtenus en Erlenmeyers d'un point de vue qualitatif et quantitatif.
En revanche, nous avons obtenu les deux nouvelles molécules induites par l'acide benzoïque (PR 14,60 et PR 16,64).

Abstract :
This work aimed to investigate the effect of some nutriments (amino acids, organic acids and humic acid) on dithiolopyrrolone antibiotic productions and also the induction of the production of new dithiolopyrrolones produced by Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137 (= DSM 44581) while growing on chemically defined medium.
The dithiolopyrrolone productions are variables according to the nature and the concentration of used sources. Cystine at concentration of 0 to 5 mM favoured dithiolopyrrolone productions by supplying good precursors. In contrast, when it was used in excess, showing a negative effect. The presence of some amino acids (L-proline, L-glutamique and DL-histidine) and some organic acids (4-hydroxybenzoic, benzentetracarboxylic, pantothenic and pivalic) favoured the dithiolopyrrolone antibiotics. In addition, the presence of humic acid (0.25 g/L) stimulated the dithiolopyrrolone productions. In contrast, some amino acids (cysteine, methionine, ethionine, etc.) and some organic acids (pamoic, benzensulfonic, syringic, etc.) had an inhibitory effect on dithiolopyrrolone productions even at low concentrations. Some organic acids are directly incorporated on the pyrrothine radical forming the corresponding antibiotic. In semi-synthetic medium, the strain produced a limited number of dithiolopyrrolones. The induced production of new dithiolopyrrolones has been achieved by the addition of some amino acids (cysteine et cystine) and organic acids (benzoic, cinnamic, 4-bromobenzoic, etc.). In our study, eighteen principal new dithiolopyrrolones have been obtained. The similarity in UV- and mass spectra between these molecules indicated that they are belonging to the same group of dithiolopyrrolones or they are precursors of dithiolopyrrolones. The data have also revealed that the molecule PR 14,60 is demethyl-benzoyl-pyrrothine, a new molecule not reported in the literature. However, the second molecule PR 1 6,64 is benzoyl-pyrrothine produced in few quantity in the complex medium.
The controlled batch fermentations were conducted in the presence of benzoic, tiglic, methacrylic and humic acids. The growth rate of Sa. algeriensis in ail fermentations was fast during the first 10 h of fermentation. The control culture showed a partially cell lysis in comparison to cultures with organic acids. As this result, these organic acids could be used for biomass maintaining. The dithiolopyrrolone productions were observed only at idiophase. The dithiolopyrrolone biosyntheses were influenced by the addition of organic acids. The methacrylic and tiglic acids increased the dithiolopyrrolone productions in some conditions. In addition, ail dithiolopyrrolone productions were decreased after 80 h of fermentation, probably due to the antibiotic degradation or transformation. The experiment in the fermentor showed some differences with results obtained in Erlenmeyers. However, the same two new dithiolopyrrolones (PR 14,60 and PR 1 6,64) obtained in Erlemneyers was also obtained in the fermentor.

Sommaire

Avant-propos
Introduction générale … 1

Chapitre I. Revue bibliographique
I.- Le genre Saccharothrix … 5
1.- Caractéristiques et position taxonomique du genre Saccharothrix … 5
2.- Espèces appartenant au genre Saccharothrix … 7
3.- Métabolites secondaires sécrétés par Saccharothrix … 8
4.- Caractéristique et position taxonomique de Sa. algeriensis NRRL B-24137 … 9
5.- Spectre d'action et antibiotiques sécrétés par Sa. algeriensis NRRL B-24137 … 11
5.1.- Spectre d'action de Sa. algeriensis NRRL B-24137 … 11
5.2.- Antibiotiques sécrétés par Sa. algeriensis NRRL B-24137 ...11
II.- Données sur les Dithiolopyrrolones … 12
1.- Caractéristiques chimiques des Dithiolopyrrolones … 12
1.1.- Propriétés physico-chimiques …12
1.2.- Propriétés spectroscopique … 13
2.- Microorganismes producteurs de dithiolopyrrolones … 1 6
3.- Spectre d'action des dithiolopyrrolones … 17
4.- Mode d'action des dithiolopyrrolones … 19
5.- Biosynthèse et synthèse chimique des dithiolopyrrolones … 19
5.1.- Biosynthèse des dithiolopyrrolones … 19
5.2.- Synthèse chimique des dithiolopyrrolones … 22
6.- Domaines d'utilisation des dithiolopyrrolones … 22
6.1- Utilisation dans l'agriculture … 22
6.2.- Utilisation dans d'autres domaines … 23
7.- Toxicité des dithiolopyrrolones … 24
8.- Résistance aux dithiolopyrrolones … 24
III.- Régulation de la Biosynthèse des Antibiotiques … 25
1.- Facteurs physico-chimiques … 25
2.- Inoculum … 25
3.- Facteurs nutritionnels … 2 6
3.1.- La source de carbone … 27
3.1.1- Régulation par les substrats glucidiques … 27
3.1.2- Régulation par les acides gras … 2 8
3.2.- La source d'azote … 29
3.2. 1.- Régulation par les ions ammonium … 29
3.2.2.- Régulation par les acides aminés … 30
3.3.- La source de phosphate … 33
3.4.- Les sels minéraux et les oligoéléments … 34
4.- Taux de croissance … 35
5.- Régulation de la production des précurseurs des antibiotiques … 35
5.1.- Cas des acides aminés et métabolisme de soufre … 35
5.1.1. - Biosynthèse et rôle de la cystéine … 35
5.2.- Cas des acides organiques … 37
5.2.1.- Origine des acides gras à courtes chaînes … 37
5.2.1. 1 -Oxydation des acides gras à longues chaînes … 39
5.2. 1 .2- Catabolisme des acides aminés et glycolyse … 39
5.2.1 .3- Activation des acides acétique et propionique … 41
6.- Signaux régulateurs … 42
6.1 .- Facteurs d'induction … 42
6.2.- Messagers nucléotides phosphorylés … 43
6.2. 1 - AMPc … 43
6.2.1- ppGpp et pppGpp … 44

Chapitre II. Matériel et Méthodes
1.- Microorganisme … 45
II.- Appareils et produits chimiques … 45
1 .- Appareillage … 45
2.- Produits chimiques … 47
III.- Milieux de culture et stérilisation … 47
1 .- Milieu de conservation et de sporulation … 47
2.- Méthode de conservation dans du glycérol … 47
3.- Milieu de pré-culture et de culture … 48
4 .- Stérilisation des milieux de culture … 49
IV.- Conditions de fermentation … 49
1.- Pré-cultures … 49
2.- Cultures en Erlenmeyers … 49
3.- Cultures en fermenteur … 50
V.- Méthodes analytiques … 50
1 .- Mesure du poids sec … 50
2.- Mesure du pH … 51
3.- Extraction des dithiolopyrrolones … 51
4 .- Dosage des dithiolopyrrolones par HPLC … 51
5.- Dosage du glucose et des acides organiques par HPLC … 53
6.- Dosage du glucose par la méthode enzymatique YSI … 55
7 .- Dosage de l'azote ammoniacal … 55
7.- Dosage de l'azote ammoniacal … 55
7.1.- Principe … 56
7 .2 .- Protocole … 56
7 .3.- Expression des résultats … 57
8.- Dosage de l'azote total … 59
8.1.- Principe … 59
8.2.- Protocole … 59
9.- Détermination des spectres UV-visible … 60
10.- Spectrométrie de masse par impact électronique direct des dithiolopyrrolones . . . 60
VI- Détermination des paramètres cinétiques microbiens et des rendements des fermentations … 60
1 .- Fermentations en fioles Erlenmeyer … 60
2 .- Fermentations en réacteur … 61
2 .1 .- Calcul des vitesses globales … 61
2 .2.- Calcul des vitesses spécifiques … 61

Chapitre III: Régulation de la production des Dithiolopyrrolones chez Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137 par les acides amines et les acides organiques introduction … 62
Résultats … 62
1.- Mise au point d'un milieu de culture semi-synthétique … 62
2.- Cinétique de croissance et de production des ditbiolopyrrolones chez Sa. algeriensis NRRL B- 24137 dans le milieu MSS … 63
3 .- Effet de addition des acides aminés soufrés à différents temps d'addition sur la croissance et la production des ditbiolopyrrolones chez Sa. algeriensis … 64
4 .- Effet de différentes concentrations de la cystéine et de la cystine sur la production des
dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis … 64
5.- Effet de la nature et de la concentration de différents acides aminés et de l'acide humique sur la croissance et la production des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis … 65
5.1.- Effet de différents acides aminés et de l'acide humique sur la croissance et la production
des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis … 65
5.2.- Effet de différentes concentrations de L-métbionine, DL-éthionine, L-proline et d'acide
humique sur la croissance et la production des dithiolopyrrolones chez Sa . algeriensis … 66
6 .- Effet de la nature et de la concentration de différents acides organiques sur la croissance et la production des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis … 67
6.1.- Effet des acides organiques à une concentration de 5 mM sur la croissance et la production des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis … 67
6.2 .- Effet de différentes concentrations des acides acétique, butyrique, pimélique, tiglique, méthacrylique, pamoïque et férulique sur la croissance et la production des dithiolopyrrolones
chez Sa. algeriensis … 68
Discussion … 69

Article 1 : Effect of amino acids containing sulfur on dithiolopyrrolone antibiotic productions by Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137
Abstarct …74
1- Introduction … 75
2- Materials and methods …76
2 .1.- Microorganism …76
2 .2 .- Culture medium … 77
2.3 .- Culture conditions … 77
2 .4 .- Measurement of DCW and pH … 77
2 .5.- High performance liquid chromatography (HPLC) analysis … 78
2 .6.- Statistical analysis … 78
3- Results … 79
3 .1.- Kinetics of growth and dithiolopyrrolone productions in Sa. algeriensis. … 79
3.2.- Effect of amino acids containing sulfur at different times of addition on growth and
dithiolopyrrolone productions in Sa. algeriensis. … 79
3.3.- Effect of different concentrations of cysteine and cystine on dithiolopyrrolone productions by Sa. algeriensis … 80
4- Discussion … 81
5- References … 84

Projet Article 2 : Regulation of dithiolopyrrolone antibiotic productions by amino acids and humic acid in Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137
Abstract … 93
1- Introduction … 94
2- Materials and Methods … 95
2 .1- Producing strain … 95
2 .2 - Culture medium … 96
2.3- Culture conditions … 96
2 .4- Measurement of DCW and pH … 96
2 .5- Dithiolopyrrolone extractions and high performance liquid chromatography analysis … 97
3- Results … 98
3.1-Effect of different amino acids and humic acid on growth and dithiolopyrrolone specifie productions … 98
3.2- Effect of L-proline, L-methionine and DL-ethionine concentrations on growth and
dithiolopyrrolone specifie productions … 99
3.3- Effect of humic acid concentrations on growth and dithiolopyrrolone specifie productions … 100
4- Discussion … l00
5- References … l03

Projet Article 3 : Control of dithiolopyrrolone antibiotic productions by organic acids in Saccharothrix algeriensis NRRL B- 24137
Abstract … 113
1.- Introduction … 114
2.- Materials and methods …114
2.1- Producing strain … 114
2.2- Culture medium … 115
2 .3- Culture conditions … 115
2.4- Measurement of DCW and pH … 115
2.5- High performance liquid chromatography (HPLC) analysis … 116
3- Results … 117
3.1- Effect of different organic acids on growth and dithiolopyrrolone specifie productions
… 117
3.2- Effect of organic acids concentrations on growth and dithiolopyrrolone specifie productions … 118
4- Discussion … 119
5- References … 123

Chapitre IV : Régulation de la production des nouvelles dithiolopyrrolones chez Saccharothrix algeriensis b-24137 par les acides organiques et les acides aminés
1- Introduction … 134
11- Résultats … 135
1.- Induction de nouvelles dithiolopyrrolones par l'addition de certains acides organiques et acides aminés … 135
1.1.- Acides organiques cycliques induisant la production de nouvelles dithiolopyrrolones … 137
1.1.1.- Acides organiques cycliques induisant la formation de AJ 1 et/ou PR16,64 … 138
1.1.2.- Acides organiques cycliques induisant la fonnation de diverses autres dithiolopyrrolones …144
1.2.- Acides organiques aliphatiques induisant la production de nouvelles dithiolopyrrolones … 146
1.3.- Acides aminés induisant la production de nouvelles dithiolopyrrolones … 151
2.- Effet de différentes concentrations de quelques acides organiques et acides aminés sélectionnés sur la production de nouvelles dithiolopyrrolones par Sa. algeriensis ... 156
2 .1.- Effet des acides benzoïque, sorbique, cinnamique et 4-bromobenzoïque sur la biomasse et la production spécifique de quelques nouvelles dithiolopyrrolones par Sa. algeriensis … 156
2.1.1.- Effet sur la production de biomasse maximale … 157
2.1.2.- Effet sur les productions spécifiques de quelques nouvelles dithiolopyrrolones … 157
2 .2 .- Effet de différentes concentrations des acides propionique et valérique sur la biomasse et la production spécifique de la nouvelle dithiolopyrrolone PR3 … 160
2 .2.1.- Effet sur la production de la biomasse maximale … 160
2.2.2.- Effet sur la production spécifique de la nouvelle dithiolopyrrolone PR 3 … 161
2.3.- Effet de différentes concentrations de cystéine et de cystine sur la biomasse et la production spécifique de quelques nouvelles dithiolopyrrolones … 162
3.- Analyses spectrométriques de masse par impact électronique direct de quelques dithiolopyrrolones nouvellement apparues … 163
111- Discussion … 166

Chapitre V : Etude cinétique de la croissance de Saccharothrix Algeriensis et de la production des dithiolopyrrolones en fermenteur batch sur un milieu semi-synthétique

I- Introduction … 180
11- Résultats … 180
1.- Effet sur la croissance de Sa. algeriensis … 180
2.- Effet sur le pH et le P(02) … 182
3.- Effet sur la consommation des substrats … 183
4.- Effet sur la production des dithiolopyrrolones … 188
4 .1 .- Effet sur l a production de l a thiolutine … 188
4 .2 .- Effet sur la production de la SEP et de l a TIP … 190
4 .3.- Effet sur la production de l'ISP et de la BUP … 192
4 .4 .- Effet sur la production de nouvelles dithiolopyrrolones … 194
VI- Discussion … 195
Discussion et conclusion générales … 197
Références bibliographiques … 202
Annexes … 238